实验标本的采集/处理和保存实验标本的采集/处理和保存 一 血清 1 采血后室温静置20min或更长时间至血清析出。 2 将采集的血液用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。 3 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 大部分检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染，因为菌体中可能含有含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。 二 血浆 1 取血后加入抗凝剂（EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠等），混合10-20分钟后，30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染（也可以直接用抗凝管采集）。 2 将采集血液用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。 3 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 注意事项：制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求，建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。 三 尿液 1 采集尿液样本500ul，加入无菌试管中。 2 用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，将离心好的样本小心收集上清，弃下面沉淀。 3 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 四 细胞培养上清 1 用无菌试管收集细胞培养上清液。 2 用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。 3 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 五 细胞裂解液 1 取细胞培养板或细胞悬液，用PBS（PH7.2-7.4）洗涤细胞培养板1-2次。 2 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂（裂解液），使细胞破坏并放出细胞内成份。 3 用离心机4℃，2000rpm离心20min左右，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。 4 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 六 组织匀浆 1 采集组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，剔除附属的结缔组织，称取组织块。 2 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天热时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。 3 匀浆的方式有多种： a) 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 b) 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 c) 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 4 将制备好的10％匀浆用离心机4℃，3000rpm离心15min，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。 5 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 保存时间 一般检测样本在2-8℃下，可放置保存24-48小时；-20℃下，可放置保存1个月；-70℃下，可放置保存6个月。 ----------------------- RayBiotech组织裂解步骤 一、裂解液的配制 1 将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用，用蒸馏水或者双蒸水稀释。 2 配制Protease Inhibitor Cocktail:将Protease Inhibitor Cocktail (蛋白酶抑制剂)小管简单离心，然后将盖子打开，加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂。 3 取20ul配制好的蛋白酶抑制剂，加入到1980u1的1X Cell Lysis Buffer中，混匀，即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞/组织裂解液，备用。 注:如果非RayBiotech的裂解液，可以使用商业化的细胞/组织裂解液，按照说明书操作即可。 二、组织裂解 4 将配制好的细胞/组织裂解液和1*PBS在冰上预冷； 5 从-80度冰箱取出冰冻组织，取10mg组织，用手术剪刀将其剪碎至1-3 mm3,转移至2ml离心管，加入500ul细胞裂解液，置冰上保持低温，匀浆机裂解组织，30s--5min (根据具体组织而定)。 6 冷冻离心机离心14000rpm 10min: 7 取上清，分装后在-80度冻存，避免反复冻融； 8 干冰邮寄 注:采用蛋白定量试剂盒定量制备的组织裂解液，蛋白浓度至少大于2mg/ml。 RayBiotech细胞裂解步骤 1 将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用，用蒸馏水或者双蒸水稀释。 2 配制Protease Inhibitor Cocktail:将Protease Inhibitor Cocktail (蛋白酶抑制剂)小管简单离心，然后将盖子打开，加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂。 3 取20ul配制好的蛋白酶抑制剂，加入到1980ul的1X Cell Lysis Buffer中，混匀，即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞裂解液，备用。 4 将配制好的2ml细胞裂解液和1*PBS在冰上预冷； 5 将细胞板放在冰上进行细胞裂解； 6 用1*PBS将细胞清洗3次，弃去1*PBS,最后一次要彻底吸干1*PBS； 7 加入200-500ul裂解液，然后将细胞刮下来，收集到EP管中； 8 将EP管在冰上放置30min,每隔5-10min涡旋摇匀30s； 9 冷冻离心机离心14000rpm 10min； 10 取上清，分装后在-80度冻存，避免反复冻融； 11 干冰邮寄 PS:也可以将悬浮细胞离心收集细胞沉淀，然后加适量裂解液进行裂解: 注:如果非RayBiotech的裂解液，可以使用商业化的细胞/组织裂解液，按照说明书操作即可。 采用蛋白定量试剂盒定量制备的组织裂解液，蛋白浓度至少大于2mg/ml。
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