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Mario Roederer是流式细胞术领域的关键领导者。

普渡大学血细胞计数实验室（）

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方案A：细胞悬浮液

材料

■ 12 x75mm圆底试管或96孔圆底微量滴定板

■ 一抗（直标或纯化）

■ 二级试剂，如有必要（间接染色法）

■ 亲和纯化抗小鼠CD16/32 (eBioscience Cat. No. 14-0161)

■ 亲和纯化人FcγR 结合抑制剂 (eBioscience Cat. No. 14-9161)

■ eBioscience® 流式细胞染色缓冲液 (eBioscience Cat. No. 00-4222)

■ eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液 (eBioscience Cat. No. 00-3222)

■ 7-AAD活性染色液 (eBioscience Cat. No. 00-6993) 或碘化丙啶染色液 (eBioscience Cat. No. 00-6990)

实验步骤

1、按第一部分——细胞制备中所描述的准备细胞。染色板包括纳米晶体试剂，细胞应该重悬于 eFluor®NC流式细胞染色液中并达到细胞终浓度为2x107/mL。

2、（选做）封闭非特异性的Fc受体交叉反应

a) 对于小鼠细胞：在染色之前细胞用浓度为0.5-1μg/100μL的纯化的抗小鼠CD16/CD32，于冰上预先孵育20min。

b) 对于人体细胞：在染色之前细胞用浓度为20μL /100μL亲和纯化的人 FcγR 结合抑制剂，于冰上预先孵育20min。

3、每个小管或小孔中加入能被50μL整除的细胞悬浮液。

4、结合每个一抗的推荐用量加入到适量体积的流式细胞染色缓冲液 （eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液） 中至终体积为100μL （即50μL细胞样品+ 50μL抗体混合），并加入到细胞中。脉冲涡流轻轻混合。

用于直接结合的抗体：

5、冰上或4℃下避光孵育至少30min。

用于纯化的抗体：

6、冰上或4℃下避光孵育至少60min。

注意：一些抗体需要非标准化的孵育条件，这些条件会在抗体技术数据表上标明。

7、通过加入流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）清洗细胞。小管中2ml或者微量滴定板每个小孔200μL。300 - 400 xg，4°C离心5min收集细胞。重复两次洗涤,弃上层洗涤液。

用于直接结合抗体：

8、如果所有用于染色的抗体都是直接结合荧光染料,这些细胞可直接在流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）中重悬。

用于纯化的或生物素结合的抗体：

9、如果用的是纯化或生物素结合一抗，下一步需添加适当的荧光标签试剂稀释于包含细胞的100μL流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）中，冰上或4°C下避光孵育15 – 30min。

10、用流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）清洗细胞。小管中加入2mL或者微量滴定板中每个小孔200μL。300 - 400 xg，4°C离心5min收集细胞。重复两次洗涤，弃上层洗涤液。

11、在流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）中重悬染色细胞。

12、（选做）加入活性染料，7-ADD（5 μL/样本）或PI（5 μL/样本）于样本中以便在分析中排除死细胞。

13、在流式细胞仪上获得分析数据。

方案B:人全血裂解液

注意事项

1、eBioscience 提供两种流式细胞术中分析全血样本的溶液。eBioscience® 1X RBC Lysis Buffer 仅溶解样本中的活体红细胞以供分析，然而1-step Fix/Lyse Solution 不仅能溶解红细胞，还能固定样本。

2、这个方案应用于在RBC细胞溶解之前的流式细胞仪全血染色液。或者，在染色之前分装的全血裂解液，每100μL的血液中加入2ml的裂解液（eBioscience® 1X RBC Lysis Buffer or 1-step Fix/Lyse Solution）。

3、如果细胞在染色前用1-step Fix/Lyse Solution分装，你需要确认在染色板上的抗体能够识别固定在表面的抗原。

材料

■eBioscience® 1X RBC Lysis Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4333) or 1-Step Fix/Lyse Solution (eBioscience Cat. No. 00-5333)

■12x75mm圆底试管

■一抗（直标或纯化）

■二级试剂，如有必要（直接染色）

■亲和纯化人FcγR结合抑制剂(eBioscience Cat. No. 14-9161)

■eBioscience® 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-4222)

■eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-3222)

实验步骤

1、每个小管或小孔中加入能被100μL整除的血液。

2、（选做）在染色之前细胞以每100μL血液中加入20μL的亲和纯化人FcγR结合抑制剂于冰上或4℃下孵育20min。

3、结合每个一抗的推荐用量加入到适量体积的流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）中至终体积为50μL。并加入到细胞中，涡流轻混。

4、冰上或4℃下避光孵育20-30min.

注意：一些抗体需要非标准化的孵育条件，这些条件会在抗体技术数据表中标明。

5、无需清洗细胞，每个管中加入2mL 常温1X RBC Lysis Buffer或1-Step Fix/Lyse Solution（微量滴定板上的每个小孔200μL），轻轻吸量以及短暂脉冲涡旋。室温避光孵育15min。在红细胞裂解液中孵育不要超过15min。

6、300-400xg ，4℃离心样品5min,弃上清。

7、用流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）清洗细胞两次。小管中2ml或微量滴定板每个小孔200μL。300-400xg ，4℃离心5min收集细胞。

用于直接结合的抗体：

8、如果所有用于染色的抗体可以直接与荧光染料结合，细胞可以直接重悬在流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）中。

用于纯化或生物素结合抗体：

9、如果用的是纯化或生物素结合的一抗，下一步中需加入合适的荧光标签试剂溶解到100μL流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）中并加入到细胞，冰上或4℃下避光孵育15-30min。

10、用流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）清洗细胞。小管中2ml或微量滴定板每个小孔200μL。300-400xg ，4℃离心5min收集细胞。重复清洗两次，弃上层洗涤液。

11、在流式细胞染色缓冲液（eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液）中重悬染色细胞。

12、（选做）用1X RBC Lysis Buffer溶解细胞的同时添加一个可行性染料至每个样本中,要么是7-AAD(5μL /样本)或是PI(5μL /样本)，以便在分析中排除死亡细胞。

13、在流式细胞仪上获得分析数据。

■亲和纯化抗小鼠CD16/32(eBioscience Cat. No. 14-0161)

■亲和纯化人FcγR结合抑制剂(eBioscience Cat. No. 14-9161)

■eBioscience® 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-4222)

■eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-3222)

■7-AAD活性染色液(eBioscience Cat. No. 00-6993) 或碘化丙啶染色液(eBioscience Cat. No. 00-6990)

■eBioscience® 1X RBC Lysis Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4333) or 1-Step Fix/Lyse Solution (eBioscience Cat. No. 00-5333)

■亲和纯化人FcγR结合抑制剂(eBioscience Cat. No. 14-9161)

■eBioscience® 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-4222)

■eFluor® NC 流式细胞染色缓冲液(eBioscience Cat. No. 00-3222)