用途

用于体外分离人外周血单个核细胞（主要为淋巴细胞），有资料显示，也适用于其他物种（如：大小鼠、恒河猴）或其他组织（如：骨髓、脐带血细胞）的分离。

方法概述

密度梯度沉降法是根据细胞密度差异，借助分离液和离心，进行细胞分离纯化的常用方法之一。分离液产生一定程度的密度梯度，将稀释后的全血铺于分离液之上。离心后，红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分离液比重漂浮于分离液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分离液中。吸取分离液液面的细胞，就可以从外周血中分离到单个核细胞。

Boyum提出了一种通过使用Ficoll甲泛影钠溶液离心快速分离的方法。稀释的血液可以在Ficoll甲泛影钠溶液中分层，通过低速短时离心。红细胞和粒细胞沉降到管底，单个核细胞（淋巴细胞）和血小板则在两个分层之间收集。不同于应用传统Boyum配方制得的淋巴细胞提取液，MPBiomedicals出品的淋巴细胞分离液（LymphocyteSeparation Medium - LSM），成功地运用泛影钠代替了甲泛影钠。

程序原理

将用纤维蛋白或肝素处理过的血液以1:1的比例用生理盐水或平衡盐溶液稀释，低速离心30分钟。由于其密度不同，最终形成不同的细胞层，大部分的红细胞和粒细胞分布在底层，淋巴细胞和其他单个核细胞（单核细胞和血小板）分布在血浆和LSM两层中间。淋巴细胞可以通过回抽分层回收，再进一步去除血小板，LSM和血浆。

试剂

LSM淋巴细胞分离液是一种灭菌过滤溶液，每100ml包含6.2g聚蔗糖和9.4g钠胺。

密度是1.0770-1.0800克/毫升20℃。

使用说明

1. 轻轻颠倒瓶子使LSM充分混合；

2. 无菌转移3ml LSM到15ml 离心管中；

3. 混合2ml经抗凝处理（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝剂均可）的全血和2ml生理盐水；

4. 仔细地将稀释好的血液加入已放有3ml LSM（室温）的15ml离心管中，在血液和LSM

中形成一个明显的分层。不要将稀释血液混合进LSM；

5. 室温下400g 离心15-30分钟，离心可以沉淀红细胞和多核白细胞，同时可以在LSM上形成一层单核淋巴细胞；

6. 吸出淋巴细胞上方2-3mm的血浆；

7. 小心吸取淋巴细胞层以及它下面一半的LSM，转移到另外的一个离心管。加入等体积的平衡盐缓冲液（如PBS）至淋巴细胞离心管中，室温离心10分钟，离心速度设定在既不损伤细胞又能沉淀细胞即可，例如160-260g，（去除LSM和降低血小板的百分比）；

8. 弃上清，用平衡盐缓冲液（如PBS）重复清洗细胞2次，根据具体的实验需求，再用适当的培养基重悬细胞。

样本要求

本分离液要求样本为新鲜的抗凝血，血液收集时应无菌操作且储存、处理和运输过程中避免冷冻和冷藏。

注意事项

1. 启封前室温避光保存，启封后应置4℃保存，避免微生物的污染；

2. LSM从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，轻轻颠倒混匀后使用；

3. 整个分离过程中，温度应控制在（20±5）℃且无菌环境下进行，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；

4. 为保持淋巴细胞的活性，采血后请尽快进行分离。分离细胞层实际上是单个核细胞层，包括淋巴细胞和单核细胞。