小鼠肠道干细胞流式分选来源：DOI: 10.21769/BioProtoc.1010306作者：陈世阳 and 陈剑峰
摘要：肠道黏膜上皮作为机体防御外界病原体的第一道防线，处于不断的自我更新和分化的状态，其自我更新的动力源于隐窝内的肠道干细胞。肠道干细胞具有持久的自我增殖和分化能力，从而维持肠道黏膜上皮快速的自我更新和损伤修复。通过流式细胞术富集分离出的肠道干细胞，不仅可以直接用于转录组、基因组测序等来研究干细胞的生物学特性，而且可以将分选得到的单个肠道干细胞进行体外的类器官培养 (Sato和Clevers，2013；Hamilton等，2015)。通过单个细胞表面标志分子如EphB2、CD24和CD166等进行肠道干细胞的流式分选，很难去除祖细胞以及部分已分化的细胞。有研究报道通过CD44+ CD24lo CD166+ GRP78lo/- c-Kit-等多个表面分子可以流式分选得到高效的肠道干细胞 (Wang等，2013)。对于小鼠肠道干细胞的分离，则可依赖于Lgr5-GFP的转基因小鼠来进行流式分选。本方案主要介绍利用Lgr5-GFP的荧光报告小鼠通过流式分选得到肠道干细胞的方法。 关键词: 肠道干细胞, 肠道隐窝, 流式分选 材料与试剂 40 μm细胞筛 (Corning, catalog number: 431750) 70 μm细胞筛 (Corning, catalog number: 431751) 巴氏吸管 (3 ml，上海晶安) 10 cm dish (Griner, catalog number: 664160) FACS管 (BD Falcon) 15 ml，50 ml离心管 (Gene Brick) Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 (Lgr5-GFP) mice (Jackson Laboratory, USA) FBS (NTC) Rat anti-CD45 (1:200, BD Biosciences, catalog number: 557659) Rat anti-CD31 (1:500, eBioscience, catalog number: 12-0311-82) Rat anti-TER119 (1:500, eBioscience, catalog number: 12-5921-82) Rat anti- EpCAM (1:300, eBioscience, catalog number: 17-5791-82) Advanced DMEM/F12 (Life Technologies, catalog number: 12634028) HEPES (Sigma-Aldrich) GlutaMax (Gibco, catalog number: 35050061) Penicillin-Streptomycin (Gibco, catalog number: 15140163) N2 supplement (Gibco, catalog number: A1370701) B27 supplement (Gibco, catalog number: 17504044) N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-Aldrich, catalog number: A9165) D-PBS (Ca2+/Mg2+ free，预冷) EDTA (Sigma-Aldrich) Y-27632 (Sigma-Aldrich, catalog number: Y0503) TrypLE Express (Gibco, catalog number: 12604021) 7-AAD Viability staining solution (Life Technologies, catalog number: 00-6993-50) Basal medium (见溶液配方) Sorting medium (见溶液配方) 仪器设备 眼用剪 (10 cm直剪, 上海三友, catalog number: 042000) 眼科镊 (10 cm弯,上海三友, catalog number: 044571) 电动移液器 (Eppendorf Easypet 3) 37 °C水浴锅 (上海精宏, catalog number: DK-420) 4 °C 离心机 (Eppendorf, model: 5804R) 流式分选仪器 (BD Aria III) 实验步骤 一、分离小鼠小肠隐窝 将6~8周的Lgr5-GFP小鼠执行安乐死后，取小鼠小肠，在离体前尽可能地去除肠系膜，用PBS冲洗肠道内的粪便，并沿肠道纵向剖开。 用ice-cold PBS将肠道组织清洗两遍，并剪成2~4 mm的小片段，转移至15 ml离心管。 向15 ml离心管中加入12 ml 30 mM EDTA-PBS，水平置于冰上，在4 °C冷库摇床孵育20 min。 将组织转移到一个新的15 ml离心管中，加入10 ml PBS，大力垂直手摇4 min。 待组织沉入管底后，将上清含有隐窝细胞的悬液过70 μm细胞筛，置50 ml离心管中 (若需要得到大量的隐窝细胞，可重复步骤3~5两到三次)。 将滤过的隐窝细胞悬液150 × g，4 °C离心10 min。 将上清小心去除，并用预冷的PBS或者advanced DMEM/F12将隐窝细胞清洗两次，离心步骤同6。 二、分离肠道干细胞 将7中分离的隐窝细胞转移至新的15 ml离心管，2 ml TrypLE Express消化液重悬，37 °C水浴锅孵育5~10 min。 用10 ml移液管吹打重悬数次，取10 μl细胞悬液于显微镜下进行镜检，> 50%细胞消化成单细胞即可。 加入终浓度为10%的FBS，并将细胞悬液滤过40 μm细胞筛。 将滤过的隐窝细胞悬液500 × g，4 °C离心5 min。 用Basal medium清洗细胞2次，离心步骤同4。 将细胞进行CD45/Ter119/CD31/EpCAM染色 (不同抗体溶度参照抗体说明书)，4 °C孵育30 min (目的是为了去除免疫细胞等非上皮细胞)。 500 × g，4 °C离心5 min，并用PBS洗两次。 将细胞重悬于Sorting medium中 (约5 × 106个/ml)，上机前5 min进行7AAD染色，以去除死细胞。 将制备好的单细胞悬液转移至FACS管中，通过Aria III进行流式分选，gating strategy: 7-AAD- CD45-Ter119- CD31- Epcam+, GFPhigh的细胞群为肠道干细胞，GFPlow的细胞群为祖细胞。 结果与分析 Lgr5-GFP小鼠的绿色荧光呈嵌合表达，约20%的隐窝细胞有绿色荧光。富集分离得到的完整隐窝如图1A，分选得到的GFPhigh和GFPlow细胞群如图1B。一只小鼠平均可分选得到1 × 105到1 × 106个肠道干细胞和祖细胞。
图1. 小鼠肠道隐窝和肠道干细胞的分离. A. 分离得到的完整的肠道隐窝。B. 流式分选得到Lgr5-GFPhigh的肠道干细胞和GFPlow的祖细胞。 注意事项 实验过程中需要用到的PBS应精确配比，高温灭菌并预冷。 实验开始前将需要用到的试剂和培养基准备好，培养基可在4 °C保存不超过2周。 B27和N-Acetyl-L-cysteine呈酸性，加入培养基后，培养基颜色呈黄色。 第一次大力手摇后可能大部分都是绒毛，如果镜检时发现隐窝细胞很少可将该组分弃掉，取隐窝细胞富集的组分进行后续实验。 在对隐窝细胞进行消化时，根据细胞量可适当增加消化液体积。隐窝细胞浓度过高会导致在消化过程中死细胞结团，影响细胞得率。 如果离心过程中出现细胞不能完全沉降下来或者贴壁情况，可提前将15 ml和50 ml离心管用FBS或者1% BSA-PBS coating。 CD45/Ter119/CD31可选用同一荧光标记的抗体。 溶液配方 Basal medium Advanced DMEM/F12 10 mM HEPES 1× GlutaMax 1× Penicillin-Streptomycin Sorting medium Basal medium 1× N2 supplement 1× B27 supplement 1 mM N-Acetyl-L-cysteine 10 μM Y-27632 致谢 陈剑峰实验室的该工作得到了中国科学院大学，生物化学与细胞生物学研究所，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的大力支持。 参考文献 Hamilton, K. E., Crissey, M. A., Lynch, J. P. and Rustgi, A. K. (2015). Culturing adult stem cells from mouse small intestinal crypts. Cold Spring Harb Protoc 4: 354-358. Sato, T. and Clevers, H. (2013). Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol 945: 319-328. Wang, F., Scoville, D., He, X. C., Mahe, M. M., Box, A., Perry, J. M., Smith, N. R., Lei, N. Y., Davies, P. S., Fuller, M. K., Haug, J. S., McClain, M., Gracz, A. D., Ding, S., Stelzner, M., Dunn, J. C., Magness, S. T., Wong, M. H., Martin, M. G., Helmrath, M. and Li, L. (2013). Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology 145(2): 383-395 e1-21. Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 引用格式： Readers should cite both the Bio-protocol article and the original research article where this protocol was used: 陈世阳, 陈剑峰. (2019). 小鼠肠道干细胞流式分选. Bio-101: e1010306. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010306. 引用格式: Chen, S. Y. and Chen, J. F. (2019). FACS Isolation of Mouse Intestinal Stem Cell. Bio-101: e1010306. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010306.
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