5.1 General活性实验常规问题

什么是Km？ Km，米氏常数。酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。 Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶Km值不同，同一种酶与不 同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反映酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。米氏 方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])　[S]表示底物浓度，Vmax表示最大酶促反应速度。 缓冲条件对激酶测定和偶联测定至关重要：使用150mM NaCl pH7.5对许多激酶都有利，但对偶联酶不太有利。如果在不同的pH 和盐浓度下进行实验，偶联酶的速率常数应在测定前新条件下测定，以确定达到最佳偶联速率的偶联酶的量。此外，新缓冲液中 还应包含Ca2+或Mg2+，因为它们是激酶的辅助因子。

检测细胞凋亡(Apoptosis)的实验方法有哪些？ 对于培养细胞的凋亡分析和定量可以结合多种方法如细胞形态学标准，提取和通过琼脂糖凝胶电泳来进行DNA分析，对固定细胞 进行DNA片段原位检测进行。其它方法还包括Caspases活性检测、检测细胞表面Annexin的结合，多ADP核糖聚合酶的剪切。 TACS® 2 TdT-Blue Label 适用于对组织切片，混合细胞，少量和难处理的细胞进行凋亡分析。它同时允许使用特异性抗体对细胞进行标记。

使用 Annexin V时如何区分凋亡细胞和坏死细胞？ 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，在早期细胞凋亡期间，磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面。先于细胞 核的改变、DNA断裂和细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞。 Annexin-V-FITC特异性高亲和力与磷脂酰丝氨酸结合，可以通过流式细胞仪进行测定。阳性标记比未标记的细胞高一到两个对 数。可以将碘化丙啶（PI）添加到Annexin标记的细胞中，以鉴定表现出质膜受损的坏死细胞，晚期凋亡细胞，受损细胞或死细胞 （PI+，ANV+）。 PI:一种核酸染料，不能透过完整细胞膜，可用于鉴定细胞膜的完整性。

使用Annexin V-FITC染色细胞时，我可以用胰蛋白酶消化贴壁细胞吗？ 发生凋亡的贴壁细胞会自动从板中分离出来，可能不需要胰蛋白酶消化。如果存在附着的细胞，则可以对其进行胰蛋白酶处理 （0.25%胰酶）而不会影响磷脂酰丝氨酸（PS）。消化时，不要采用EDTA的消化液（反应需要钙离子）。设置好对照，并在染色 1小时内分析。

5.2 Caspase Activity Assays 细胞凋亡蛋白酶活性检测

什么是Caspase（细胞凋亡蛋白酶） Caspase是胞浆天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的家族，参与细胞凋亡的启动和执行。它们表达为潜在的酶原，并通过自蛋白水 解机制或通过其他蛋白酶（通常是其他Caspase）的处理而被激活。人Caspase可分为三个功能组：细胞因子激活（caspase-1， -4，-5和-13），凋亡启动（caspase-2，-8，-9，-10）和凋亡执行（caspase-3，-6和-7）。

Caspase活性实验是否仅对说明书中指定的Caspase有特异性？ Caspase活性实验包含了被测定的单个Caspase偏好的底物。然而这些底物都不对一种Caspase具有完全特异性。如果需要更高的 特异性，请考虑使用特异性捕获抗体的ELISA。

Caspase活性实验与Caspase ELISA试剂盒有何不同？ Caspase ELISA试剂盒可测量样品中Caspase的总量，而与Caspase的活性水平无关。这些试剂盒由于使用抗体来识别caspase而 比活性实验更具特异性。无论Caspase的总量是多少，Capase活性实验都能对不同样品中的Caspase活性进行定性比较。 Caspase酶的特异性不是绝对的，而是相对特异性的。活性实验利用肽的裂解作为活性的量度。尽管Caspase可能偏好特定的肽 序列，但它可能会在合适的条件下或在足够的时间内裂解相似的序列。

R&D Systems®是否为Caspase活性实验提供了阳性对照？ R&D Systems®提供了多种重组Caspase酶，非常适合用作阳性对照。产生阳性对照的方法包括将细胞与2 µM星形孢菌素（Staurosporin）孵育2小时，会在大多数细胞类型中诱导凋亡。

Caspase-3荧光实验试剂盒与比色实验试剂盒的灵敏度差异？ 凯发k8官网尚未比较过荧光法（Catalog＃K105-100）和比色法（Catalog＃K106-100）Caspase活性实验的灵敏度相关性。

Caspase活性实验试剂盒中AFC的工作原理 报告分子7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）的分子式为C10H6NO2F3，分子量为229.16。它的货号为B-210。该类试剂盒是半定 量的。用于确定凋亡细胞中Caspase活性相较于未诱导细胞的增加倍数。推荐使用背景对照（反应体系中不添加细胞裂解物或底 物）。如果该对照得到实质性的读数，则应在计算倍数增加之前从实验结果中减去该读数。

Caspase活性实验试剂盒如何使用？ Caspase活性实验提供了一种简单方便的方法来测定细胞裂解液中的蛋白酶活性。裂解Caspase特异性肽底物后，可以使用比色 或荧光微量滴定板读数器对游离的报告分子进行定量。从凋亡样品产生的信号与未诱导的对照进行比较，可以确定Caspase活性 的增加倍数。Caspase活性水平与检测到的信号成正比。

不同Caspase活性实验试剂盒中的细胞裂解液是否一样？ 是的，所有Caspase活性试剂盒中的细胞裂解缓冲液均相同。因此，一次裂解细胞的样本，可以用于多种Caspase活性实验检测。

5.3 TUNEL分析

TdT和TACS-XL两种不同类型的TUNEL的差异？ 有两种不同的TUNEL（末端dUTP缺口末端标记）方法用于细胞凋亡检测。 第一种使用TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）将生物素化的核苷酸掺入DNA片段的3'-OH末端。通过添加阳离子可以优化该标记。 然后通过使用链霉亲和素-HRP-耦合物和底物来检测生物素化的核苷酸。 另一种方法TACS-XL试剂盒也是使用TdT将核苷酸掺入DNA片段的3'-OH末端。但是，这些核苷酸是BrdU标记的，而不是直接生 物素化的。然后将生物素化的抗BrdU抗体用于检测。BrdUTP的更有效结合可以改善信噪比。

TACS-XL三种试剂盒（4828-30-K，4828-30-DK，4828-30-BK）的差别？ 三个试剂盒的原理是一样的，基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT）介导BrdU插入DNA片段的3'-OH，再用HRP偶联的BrdU抗体检 测。之后可以选择基于HRP的不同显色系统例如TACS•XL-DAB或者TACS•XL-Blue。 4828-30-K是Basic的试剂盒，相比4828-30-DK和4828-30-BK，它不含制作阳性对照的试剂例如TACS-Nuclease(货号 800-30-15)，也不含显色组分例如TACS•XL-DAB显色系统或者TACS•XL-Blue显色系统。 TACS•XL-DAB（货号4828-30-DK）显色为深棕色。 TACS•XL-Blue（货号4828-30-BK）显色为深蓝色，并伴有淡红色的共染试剂背景（Nuclear Fast Red Counterstain）。

PAR和PARP分析的原理是什么？ 聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是一种存在于所有体细胞中的丰度酶，可检测DNA损伤并向修复机制发出信号。使用NAD作为 底物来催化ADP-核糖向各种核蛋白受体的共价转移。又称为NAD（+）ADP-核糖基转移酶1; 细胞修复需要ADP核糖基转移酶，而 DNA中的单链断裂可诱导PARP表达。它响应单链DNA断裂而被激活，随后附着在受损的DNA区域。然后，PARP催化自身和邻近 核蛋白（例如组蛋白）上的聚（ADP-核糖）（PAR）链的合成。PAR链可作为其他DNA修复酶的信号。修复DNA后，PAR链被 PAR糖水解酶（PARG）降解。 PAR合成利用NAD+。广泛的DNA损伤可导致细胞内NAD+耗竭和能量耗竭引起的坏死。在这方面，PARP被caspase特异性切 割，因此不再具有活性，从而阻止了DNA修复并促进了凋亡过程。

5.4 CometAssay® 彗星电泳实验

彗星实验可用于实体组织检测吗？如果可以，如何使用？ 如果使用FLARE™Assay或CometAssay®Kit，请按照以下说明从组织中制备单细胞悬液。当使用CometSlide™2孔每孔扩散50 µl 时，以每毫升1 x 105个细胞的50 µl细胞悬液与500 µl LMAgarose结合使用，可提供正确的琼脂糖浓度和细胞密度，以获得最佳结 果。 组织准备：将一小块组织放入1-2ml冰冷的1X PBS（不含Ca2+和Mg2+），20mM EDTA中。用小的解剖剪刀将组织切成小块，静置 5分钟。收集细胞悬液，避免碎片转移。计数细胞，离心沉淀，并以1x105个细胞/ml悬浮在冰冷的1XPBS（不含Ca2+和Mg2+） 中。 对于血液丰富的器官（例如肝脏，脾脏），将组织切成更大的碎片（1-2mm3），静置5分钟，然后吸出并丢弃培养基。在1XPBS （不含Ca2+和Mg2+）中加入1-2ml冰冷的20mM EDTA，将组织切成小块，静置5分钟。收集细胞悬液，避免碎片转移。计数细 胞，沉淀，并以1 x 105个细胞/ ml悬浮在冰冷的1X PBS（不含Ca2+和Mg2+）中。

客户没有彗星电泳仪器，是否有其他替代方法 可以推荐R&D Systems®的AF2288：Human Phospho-Histone H2AX (S139) Antibody，彗星电泳是基于损伤DNA理化性质的改 变检测，H2AX是基于DNA损伤后形成产物检测。 H2AX是组蛋白H2A家族成员之一，包含一个进化保守区域SQ位于真核细胞的C末端，分子量为14KD，139位有个丝氨酸残基， 在细胞发生DNA双链断裂后的数分钟内，将会被ATM,ATR和PRKDC磷酸化，形成γH2AX，进而迅速招募DNA修复蛋白和凋亡蛋 白到损伤部位，每个双链的断裂区会有成百上千的γ-H2AX，然后在1h左右数量和密度达到峰值。由于γH2AX的出现与DNA双 链断裂紧密关联，是目前国内外研究细胞DNA双链断裂应激反应的热点之一，同时也可以作为DNA双链断裂的标志物。

SYBR®GOLD的最佳过滤器是什么？ SYBR®Gold的最大激发/发射波长为496 nm / 522 nm。荧光素过滤器已足够。

哪些图像分析工具可用于对彗星评分？ Trevigen (已并入R&D Systems®) 现在提供了突破性的软件（4260-000-CS），旨在改善，标准化并使彗星分析变得更加容易。该 软件将自动从数字图像中找到彗星并对其评分，以表征和量化彗星试验揭示的DNA破坏程度。它与FLARE™分析，CometAssay® 和CometChip®试剂盒兼容。Comet分析软件可以快速评估与研究中每个治疗组或筛选目标相关的大量细胞，并根据相应的数字 结果生成汇总统计信息。

为什么在阳性对照（例如过氧化氢）中没有彗星尾巴的证据？ 样本未能充分裂解，无法在碱中变性或无法正确进行电泳均可能产生不良结果。 对CometAssay®试剂盒的建议： 1）尝试在4°C下过夜裂解。 2）在室温下进行20分钟的碱变性，或在4°C下进行至少1小时的碱变性。 3）从氢氧化钠颗粒中制备新鲜的碱性溶液。 4）使用新鲜的过氧化氢造成损伤。

pH对碱性电泳缓冲液的重要性是什么？ 答案将取决于所分析的DNA损伤加合物。在pH 12.1时，分析的是初始断裂，而在pH 12.5和pH 13时，将碱不稳定的加合物转化 为断裂。在pH 12.5时，脱碱基损伤会转变为单链断裂，而在pH 13时，其他不稳定部位会转变为单链和双链断裂。 在FLARE™分析，CometAssay®和CometChip®试剂盒中，pH为13时，可以看到由试剂造成的最大损害。

出现阴性对照显示的DNA损伤比粘附细胞中预期的要多的情况怎么办？ 减少细胞与胰蛋白酶的接触或尝试其他分离方法。

建议： 在37°C的PBS / 1 mM EDTA中孵育10分钟，然后用胰蛋白酶处理2分钟。 在冷胰蛋白酶中于4°C孵育30分钟。 可以使用冷EDTA（2 mM）代替胰蛋白酶来分离细胞。 通过使用细胞橡胶刮板来分离细胞。 以小于200xg的速度离心细胞10分钟，以避免DNA损伤。

光照对彗星实验有什么影响？ 样品可以在普通实验室灯下处理，但裂解和碱中变性步骤应在黑暗中进行。电泳通常使用Trevigen(已并入R&D Systems®)的CometAssay®电泳系统（4250-050-ES）等系统设计，以最大程度地减少暴露于紫外线照射。

FLARE™或CometSlides™玻片可以存储多长时间？ 在用SYBR™Gold染色之前，可以将干燥的玻片与干燥剂一起保存更长的时间（数月）。 使用CometAssay®银染试剂盒（4251-050-K），可以永久保存，并可以使用标准光学显微镜进行观察。

如果将相同的pH值用于碱变性和碱电泳是否重要？ 相同的溶液（> pH 13）用于碱变性和碱电泳。为避免因pH值引起的变化，应制备新鲜缓冲液。 在pH 12.1时，分析初始断裂，而在pH 12.5和pH 13时，将碱不稳定的加合物转化为断裂。在pH 12.5时，无碱基损伤会转变为单 链断裂，而在pH 13时，其他不稳定部位会转变为单链和双链断裂。在CometAssay®和FLARE™Assay中，pH为13时，可以看到 由试剂造成的最大损害。

CometSlides™是否需要使用盖玻片？ FLARE™和CometSlides™被设计为不使用盖玻片，因为去除盖玻片可能会导致琼脂糖分离并损坏样品。

在FLARE™分析中，什么类型的盖玻片用于在整个酶上很好地分布？ 加入75 µl酶溶液后，可以用Trevigen   (已并入R&D Systems®) 疏水盖玻片（4867-100）覆盖孔，以均匀分布酶测试稀释液。

可以使用2孔的CometSlides™代替3孔的FLARE™玻片吗？ 可以，CometSlide™的2孔和FLARE™Slide 3孔的孔尺寸是相同的。他们任一玻片都可以用于FLARE分析。

可以结合使用防褪色和SYBR® GOLD吗？ 只能在应用之前混合溶液。储存防褪色和SYBR®Gold的混合物会发生沉淀。

您是否建议对全血使用彗星检测？ 凯发k8官网不建议在彗星试验中使用全血，因为样品制备至关重要，并且血红蛋白可能会破坏DNA。重要的是要注意，脊椎动物的红细 胞（主要血液成分）没有核（鸟类除外），因此不适合与CometAssay®一起使用。

在SYBR®GOLD染色前，FLARE™玻片或CometSlides™可以保存多长时间？ 将载玻片浸入70％乙醇中5分钟并干燥，在染色前可在室温下保存1年。

因有时间限制，是否有方便的步骤来停止彗星实验并在第二天继续？ 裂解步骤可以在4°C下进行30-60分钟或过夜。否则，除染色外，必须完成整个彗星试验步骤，直到载有样品的载玻片完全干燥为止。然后可以在此阶段评分之前，将载玻片与干燥剂一起在室温下保存。

为什么阳性对照细胞中的彗尾比预期的要小？ CometAssay®电泳系统（4250-050-ES）提供了每种载玻片的电泳时间。对于其他系统，需要优化电泳时间。 验证细胞裂解。裂解溶液应在室温下长期保存，并在使用前冷却至4°C。裂解液长期储存在4°C下会沉淀。

如果未使用所有孔，彗星实验的玻片是否可以重复使用？ FLARE™和CometSlides™包含用于结合琼脂糖的特殊涂层，如果清洗再使用，涂层可能会受到损害，凯发k8官网不建议重复使用。

彗星实验的银染两孔载玻片需要每孔100 µl。二十孔玻片的染色量是多少？ 使用20孔载玻片时，可将彗星测定的银染量减少至每孔50 µl。

蔡司Axioplan / Axiovert显微镜能否用于观察彗星载玻片 蔡司Axioplan / Axiovert显微镜可用于查看FLARE™或CometSlide™。

SYBR®Green I的哪些染色替代品适用于彗星实验？ 建议使用SYBR®Gold核酸凝胶染料（在DMSO中浓缩10,000X）。 不太敏感的替代品有： 1. cr啶橙（50 µM）：单链断裂显示为红色，双链断裂显示为黄绿色。 2. 溴化乙锭（20 µg / ml）：双链断裂比单链断裂更有效地结合。 3. DAPI（1 µg / ml）：与DNA的主要凹槽结合，荧光依赖于双链结构。 4. 碘化丙锭（2.5至20 µg / ml）：通过插入碱基之间与DNA结合 5. Hoechst 33258（0.5 µg / ml）：结合DNA的小沟。

如何避免彗星玻片上琼脂糖片的丢失？ FLARE™和CometSlides™经过特殊处理，可在碱性处理过程中增强琼脂糖结合。 建议： 需要特别注意将琼脂糖/细胞混合物均匀地铺在整个玻片孔中。注意避免琼脂糖上色。 始终将玻片放入溶液中；切勿在彗星玻片上方倒入或倒出缓冲液。 最大限度地减少玻片在碱性缓冲液中时间。遵循建议的孵育时间。 在与LMAgarose合并之前，在PBS中冲洗并悬浮细胞以除去培养基。 不要将细胞与熔融琼脂的比例超过1：10。 将载玻片在4°C放置15分钟，以确保裂解前琼脂完全胶凝。

是否有商用水平凝胶电泳仪可用于彗星分析？ 针对FLARE™分析，CometAssay®和CometChip®试剂盒描述的电泳条件已针对CometAssay®电泳系统（4250-050-ES）进行了 优化。传统的平板凝胶电泳室无法消除已知的彗星测定变异性（碱性pH，缓冲液高度，温度，载玻片方向）的原因。可以使用它 们，但是用户需要对其进行优化才能获得一致的结果。

CometAssay®对照细胞应如何保存？ CometAssay®对照细胞应储存在液氮中。为了避免由于冻融而造成的损害积累，CometAssay®对照细胞应融化并冷冻成等分工作 用样。

什么细胞系用于生成CometAssay®对照细胞？ CometAssay®对照细胞是使用永生化的人类淋巴细胞系制备的。

哪种DNA破坏剂用于创建CometAssay®对照细胞？ 用DNA损伤剂处理健康的对照细胞群（C0），以分别增加群体C1，C2和C3的损伤程度。依托泊苷Etoposide是用于碱性对照细 胞（CC0-CC3）的破坏剂，而博来霉素是用于中性对照细胞（NC0-NC3）的破坏剂。

碱性CometAssay®对照细胞可用于中性彗星实验吗？ 碱性CometAssay®对照细胞适合进行碱性彗星测定，而中性 CometAssay®对照细胞适合进行中性彗星检测。

如何使用CometAssay®对照细胞？ CometAssay®对照细胞旨在帮助标准化和比较个人用户和实验室之间的碱性和中性电泳方法。对照细胞含有已知水平的损伤。

添加到LMAgarose中之前，有必要在PBS中冲洗CometAssay®对照细胞吗？ 是的，必须使用PBS冲洗CometAssay®对照细胞，以消除会降低LMAgarose对玻片粘附的培养基和储存因素。

离心CometAssay®对照细胞后，为什么看不到可见的细胞沉淀？ 离心后，由于细胞数量少，沉淀物将不可见。

为什么在对CometAssay®对照细胞染色后看不到彗星？ 细胞离心后，保留约50 µl上清液，以避免在吸出上清液时细胞丢失。如有必要，可以将离心速度提高到500xg。

为什么健康的CometAssay®对照细胞种群中有彗星尾巴？ 对照细胞是由异步细胞群体制备的，细胞群处于细胞周期的各个阶段。 不要将CometAssay®对照细胞保存在-80°C下。分装在液氮中。

是什么导致彗星尾巴出现，但在经过处理的对照细胞中不显著呢？ CometAssay®对照细胞描述的电泳条件已针对CometAssay®电泳系统（4250-050-ES）进行了优化。传统的平板凝胶电泳系统无 法消除已知的彗星测定变异性（碱性pH，缓冲液高度，温度，载玻片方向）。因此，使用非配套电泳系统，用户需要对其进行优 化才能获得一致的结果。 未能裂解，无法在碱中变性或无法正确执行电泳可能会产生不良结果。建议从NaOH颗粒中制备新鲜的碱性溶液，并在4°C下将碱 性溶液中的时间延长至1小时。

5.5 糖生物学检测

糖生物学检测试剂盒有哪些？ R&D Systems®提供了新颖的非放射性分析方法，用于分析糖生物学相关酶（包括糖基转移酶（EA001），唾液酸转移酶（EA002） 和磺基转移酶（EA003）的活性。

分析糖生物学相关酶活性的原理是什么？ 凯发k8官网的糖生物学试剂盒的测定程序包括制备包含供体分子，受体底物和偶联磷酸酶的反应混合物。然后通过添加糖生物学相关的 酶来引发反应。特定的磷酸酶从酶促反应过程中产生的核苷酸释放无机磷酸盐，这可以使用比色试剂进行检测。由于释放的磷酸 盐浓度与反应过程中转移的分子数量成正比，因此这些试剂盒为研究人员提供了一种简单的非放射性方法，用于测量糖生物学相 关酶的动力学参数

5.6 Tocris Bioscience®小分子及多肽

Tocris Bioscience®小分子纯度的定义，分类和QC 纯度：在线产品信息页的技术数据部分中显示的纯度是任何给定批次将包含的活性成分的最低含量。由于制造工艺的原因，可能 会发生少量批次变化，这些变化对材料的生物学特性没有影响。 生物活性化学纯度：Tocris Bioscience®生物活性化学品的纯度很高，通过HPLC通常> 99％。有关单个产品的纯度，请查阅特定 批次的分析证书（COA）。 同位素纯度：同位素纯度是产品中稳定同位素的百分比。 肽纯度：除非另有说明，否则Tocris Bioscience®提供的肽的纯度>95％。有关单个产品的纯度，请查阅特定批次的分析证书 （COA）。 质量控制：使用一系列技术评估化学纯度，这些技术包括HPLC，手性HPLC，NMR，微分析，高压电泳，熔点，旋光度，TLC和 质谱。所有数据均已存档，可应要求提供检查。有关详细信息，请与凯发k8官网联系。凯发k8官网相信Tocris Bioscience®提供的任何材料的 纯度都将达到或超过科学文献中最初报道的产品的纯度。

如何确定半衰期 药物在体内的半衰期是其在血浆中的浓度降至原始水平的一半所需的时间。当Tocris Bioscience®化合物的该信息为已知时，凯发k8官网 会在产品生物学说明中标注。由于某些Tocris Bioscience®产品的新颖性，此信息可能无法在已出版的文献中获得。因此，凯发k8官网可 能无法为这些产品的半衰期提供明确的信息。

Tocris Bioscience®产品的分子量（MW）及CAS号是如何规定的？ 产品页面中显示的分子量表示由产品化学结构确定的理论分子量。在产品生产过程中，通常会有溶剂（例如水和乙醇）掺入。由 于生产工艺的选择及差异，造成批次之间的反应程度不同，最终产物的分子量可能不同。不同批次分子量的差异不会影响化合物 的基本药理性质，但会影响所进行的任何浓度计算。 只要化学方程式发生改变，那么CAS号便会改变，MW也会相应改变。产品的实际信息以CoA中特定批次信息为准。 例如产品C26H36N2O5.HCl理论分子量为493.04，但是生产工艺导致会有水残留，即分子式中最后有1/2个水分子（分子量为 9），C26H36N2O5.HCl.½H2O，分子量为502.05

如何溶解小分子或肽类产品？ 在可能的情况下，凯发k8官网提供了溶解肽的特定溶解度说明。如果没有具体说明，则可以使用以下准则。大多数肽可溶于蒸馏水。如 果它们不能完全溶解，则为碱性肽（含有Arg，Lys，His的那些）添加1.0 M乙酸或为酸性肽（含有Asp，Glu的那些）添加1.0 M 氢氧化铵可能会有所帮助。 10％DMSO或DMF可以帮助溶解高度不溶的肽，尽管使用这些肽可能会干扰某些生物学检测。超声处理对于溶解肽也可能是有 用的辅助。溶解肽时，建议将肽溶解至最高浓度，然后用水或缓冲液稀释至工作浓度。

如何确定肽的净重？ Tocris Bioscience®出售的大多数肽是以肽的净重提供的。装瓶时，肽可能包含抗衡离子和残留水。因此，尽管特定肽的纯度可 以被引用为98％的纯度，但是净肽含量可以仅为70％。为了弥补这一点，凯发k8官网对肽段进行质量计算，以使接收到的肽段的数量 与小瓶上标明的数量完全相同。例如，对于1 mg净含量为70％的肽，实际上要提供1.43 mg物质（1 / 0.7）。

如何确定肽纯度？ 除非另有说明，Tocris Bioscience®提供的肽的纯度>95％。纯度通过HPLC，质谱和/或氨基酸分析等进行评估，其中的详细信息 可按要求提供。

肽的稳定性如何和如何存储？ 肽以冻干形式提供，应在-20°C下保存。吸水会降低肽的稳定性，因此请确保将产品存储在有干燥剂的封闭干燥环境中。避免将肽储存在无霜的冰箱中，因为水分和温度的变化可能会影响稳定性。在使用前和打开小瓶之前，建议使肽平衡至室温至少60分 钟。避免多次冻结/解冻循环。不建议将肽长期保存在溶液中，因为这会降低稳定性。 溶液中的肽比冻干形式的肽稳定性差得多。对于其序列包含诸如Cys，Met，Trp，Asn，Gln和N-末端Glu的氨基酸的肽尤其如 此。因此，凯发k8官网建议将肽在溶液中保存的时间尽可能缩短。通过将肽溶液分装并储存在-20°C，避免重复的冻融循环。解冻后未 使用的分装试样的任何部分均应丢弃。溶液中存储的肽有时可能对细菌降解易感。凯发k8官网建议使用通过0.2μm过滤器的溶液或无菌 溶液，以尽可能去除潜在的细菌污染。

如何配制摩尔当量（eq）溶液？ 在制备某些氨基酸的水溶液时，通常使用溶解助剂，例如1摩尔当量（1eq）的氢氧化钠（NaOH）。凯发k8官网通常建议使用100 mM 氢氧化钠溶液溶解活性化合物。 实验方案： 第1步 使用化合物的批次特定分子量（MW），计算添加1 L溶剂时制备100 mM溶液所需的克数：（MW / 10）=克数（X） 第2步 从中计算出添加1 ml溶剂时制备100 mM溶液所需的克数：（X / 1000）=克数（Y） 第3步 现在可以将1 ml的NaOH储备溶液（浓度为100mM）添加到该重量（Y）以溶解该化合物。在某些情况下，溶液的加热或超声处 理可能有助于溶解。 工作实例： 谷氨酸（货号0217）的批次MW = 147.13 对于100 mM溶液：1L中的MW / 10 = 14.7 g 制备1 ml 100 mM溶液所需的量： 14.7 / 1000 = 14.7 x 10 -3   g / 1 ml= 14.7 mg / 1 ml 称量14.7毫克的谷氨酸 加入1 ml NaOH（100 mM）= 1毫升中的1毫升100 mM谷氨酸溶液/氢氧化钠 然后可以将该溶液（用水）进一步稀释至所需工作浓度。

Tocris Bioscience®产品外观-为何肉眼看不到产品 有些产品，尤其是少量或冻干固体形式的产品，可能难以肉眼观察到。这些产品在小瓶的底部和壁上可能显示为透明的薄膜。

Tocris Bioscience®产品是无菌的吗？ Tocris Bioscience®产品不会在无菌条件下称量。为了获得无菌溶液，凯发k8官网建议您配制溶液，然后使用0.2μm的微滤器进行过滤。

Tocris Bioscience®产品生物活性如何？是否做过动实验？ 重要的是要记住，凯发k8官网所有关于Tocris Bioscience®产品线中化合物的生物活性的信息都来自已发表的文献，凯发k8官网不进行内部测 试。由于Tocris Bioscience®不是一个研究机构，凯发k8官网的目标是为想要进行进一步研究的研究人员提供最广泛的化合物(其中许多 很难找到)。在某些情况下，凯发k8官网提供的商品可能是市面上唯一的，否则研究人员需要自己进行有机合成。 凯发k8官网依靠外部文献来对凯发k8官网的产品进行生物学特性描述。因此凯发k8官网只能基于文献给您相关的建议，但是无法保证产品的具体活性 及用法用量。

什么是dTAG TAG降解平台（DTAG / ATAG）是基于TPD（靶向的蛋白质降解）的目标验证方法，使用异双降解剂靶向融合蛋白。dTAG利用 泛素/蛋白酶体系统快速，高选择性降解包含突变FKBP12和目标靶蛋白的一系列融合蛋白。它可作为遗传学方法的替代方法用于 靶标验证，可用于细胞培养或体内。TAG系统具有验证没有已知配体的靶标的潜力。

什么是PROTACs? PROTACs的工作原理是什么？ PROTAC，也称为活性降解剂，由E3泛素连接酶和通过接头连接的靶蛋白的结合部分组成。两个部分的结合导致靶蛋白和E3连 接酶之间形成三元复合物，导致靶蛋白的多泛素化，其被蛋白酶体识别并随后降解。