小鼠肠道类器官可使用 IntestiCult™类器官生长培养基（小鼠）（产品号#06005）进行构建并维持长期培养。下文中列出了确保成功分离小鼠肠道隐窝和培养小鼠肠道类器官的关键步骤。

常规提示：

在整个过程中，在操作肠段或者隐窝之前，应预先将移液管和移液头湿润，从而预防组织粘 连到移液管壁上。 为对细胞的破坏降至最低并确保最大限度地回收细胞，在室温条件下使用 IntestiCult™类器 官生长培养基（小鼠）培养基和温和细胞解离试剂 （GCDR），但用于清洁和洗涤过程的 PBS 和 DMEM/F12 则需保持冰冷。 有关采用 IntestiCult™培养肠道类器官的概要请观看本视频。

分离小鼠肠道隐窝：

在处理肠道的过程中，应先清除肠系膜（连接肠道与腹壁的膜），然后才切割小肠。如果肠 系膜未预先去除，在随后的洗涤步骤中肠段则难以沉降。 将肠道切割为 2mm 的小段之后，为确保肠段干净，需要在 PBS 中冲洗 15 至 20 次。如果冲 洗次数少于 15 次，则皱襞部分可能会残留一些有毒物质，对类器官的生长产生不利影响。

在冲洗过程中需通过重力实现肠段的沉降。若使用离心分离可能会导致其他杂质沉淀，而导 致隐窝收获率降低。 将肠道隐窝铺板生成类器官：

隐窝经分离后进行铺板时，必须使用预热处理的培养板和水冷的 Matrigel®，这样才可确保 隐窝悬浮。如果隐窝接触并粘在孔的表面上，将会出现分化现象。 含有肠道隐窝的 Matrigel®滴液凝固之后，沿孔壁一侧向孔中添加 IntestiCult™培养基。如果培养基直接加入到 Matrigel®的液滴上，液体的作用力会破坏圆顶状的 Matrigel®液滴。 IntestiCult™培养基应完全覆盖圆顶状的 Matrigel®液滴。 非常重要的是，隐窝应使用三种不同密度进行铺板。培养基和类器官本身均能够产生促使类器官扩增和成活所需的因子。如果隐窝的接种密度过大，则隐窝无法从培养基中吸收充足的营养，实现适当扩增。如果隐窝的接种密度太小，则类器官无法产生充足的因子，从而也会导致无法实现适当扩增。

传代肠道类器官培养物：

类器官开始萌芽时，应对类器官进行传代。当细胞死亡时，它们进入管腔，使之变得阴暗。 建议在显微镜下观察，确保在类器官培养物管腔变暗之前对其进行传代。 在传代过程中，解离类器官有两个要素：在 GCDR 中进行孵育时间以及使用移液管手动搅拌的力度。如果在 GCDR 中对类器官的孵育时间过长或者搅拌过度，则可能会出现过多的单细 胞，应避免这种情况。