无染色/弱染色

一般情况

1.抗体贮藏和操作不当

抗体应保存在2-8℃中。荧光结合抗体不应暴露在光线下，应避免冷冻。确认说明书提示和贮藏和操作条件。

2.荧光染料淬灭

荧光抗体和荧光抗体染色后的样本都应该避光保存。

3.自发荧光较高

细胞的自发荧光取决于细胞的类型，也可能受到细胞制备方法的影响。自发荧光较高会遮盖阳性染色。改变抗体的荧光染料形式，避开与自发荧光相同发射光的染料。例如，由黄色、绿色、红色激光和红外线激光（650nm）激发的荧光染料。

染色方案

4.抗体不是最佳浓度

通过抗体滴定，找到该实验的最佳浓度。

5.染色时间和温度不正确

一些克隆在较高温度下和/或较长染色时间下的染色效果较好。有关孵育时间和温度的建议，请参见产品说明书。

6.使用的二级抗体不正确

使用的二级抗体必须配一级抗体的物种（例如：如果一级抗体来自于小鼠，则使用抗小鼠二级抗体）。确保使用正确的二级抗体。

7.使用错误的缓冲液染色细胞内蛋白

为了获得最佳细胞内蛋白染色，应该使用正确的缓冲液系统进行细胞固定并破膜，以检测胞浆和细胞核蛋白。有关最佳缓冲液系统的信息，请参加产品说明书。

8.洗涤不充分

洗涤不充分可导致背景值过高，遮盖阳性结果。确保使用推荐的染色方案和洗涤方案。

抗原

9.分泌性保内蛋白

流式细胞检测时，细胞因子、趋化因子和生长因子等分泌性蛋白必须保留在细胞内。使用莫能霉素、不累菲尔德菌素A或者两者联合使用。

10.未知的蛋白表达

使用明确表达的样本作为阳性对照。

11.蛋白质下调、内化或从细胞中被剪切

确定使用的刺激条件不会影响蛋白质定位。改用细胞内染色可以改善已被内化的蛋白质的检测，例如CD152(CTLA-4)。为防止蛋白质被剪切，可以在染色前/后立即固定；如果能在染色前固定，确保抗体能够识别固定后的表位。

12.蛋白的表达水平过低

对于表达水平过低的抗原，染色时使用最亮的荧光染料。两步法染色有时可以提高敏感性，例如先使用生物素化抗体，再使用荧光结合二级抗体染色。

13.细胞的分离方案或冷冻贮藏破坏抗原

从固态组织或细胞培养皿中收集细胞使用的酶会破坏细胞表面蛋白质。尝试用非酶的试剂制备细胞，例如10Mm EDTA。检查制备细胞的试剂盒细胞贮藏/处理，是否可能影响抗原。

14.染色前固定

抗体无法识别固定后表位，只能用于固定前染色细胞。能识别固定表位的抗体，请了解“固定/破膜后抗体克隆的性能”。

15.抗体与其他物种的交叉反应

只有物种之间抗体表位相同的情况下，抗体才能辨识其他物种。

流式细胞仪

16.激光器性能异常

使用流式细胞仪设定&跟踪微球，以检查激光的校准和功能，细胞仪可能需要专人进行维修。

17.使用的滤片不正确

检查所用荧光染料的激发波长与发射波长，确保使用正确的激光和滤片收集数据。

18.数据过度补偿

利用单染色对照和荧光减一（FMO）对照为每次实验设定补偿。

19.细胞群的设门不正确

确保对细胞群的正确设门。其他指标共染色有助于判断分析的细胞群是否正确。使用活性染料并对单细胞群设门，可大幅度减少假阳性。

20.数据分析不正确

为最佳显示西游细胞或染色暗淡的细胞，利用双参数图观察细胞。

21.染色前固定

抗体无法识别固定后表位，只能用于固定前染色细胞

高背景/非特异性染色

一般情况

1.自体荧光较高.

细胞的自体荧光取决于细胞的类型，也可能受到细胞制备方法的影响。使用相同刺激条件，但不同任何实际染色的样本作为细胞自体荧光的对照。

2.抗体与死细胞结合

染色中包含使用活性染料染色，来排除死细胞。FVD是最好的选择，特别是与细胞内蛋白染色联合使用。

3.Cy5染料

Cy5和其他基于青蓝色的染料，会与特性细胞的Fc受体非特异性结合，例如：单核细胞

和巨噬细胞。如果涉及到此类非特异性结合的细胞，考虑使用其他荧光染料。

染色方案

4.抗体浓度过高

滴定抗体的用量。建议进行两倍梯度稀释。推荐的起始浓度，参见产品说明书。

5.二级抗体/试剂非特异性结合。

滴定二级抗体，使本底降至最低程度。阻断Fc受体。确保使用已经被高度认可无非特异性的二级抗体。

6.染色时间太长

根据实验细胞表达，优化抗体浓度和孵育时间。

7.洗涤不充分

增加染色后的洗涤次数。

8.Fc阻断不充分

使用Fc阻断试剂。列如，用于小鼠细胞的抗小鼠CD16/32,和用于人体外周血细胞纯化的人Fc受体结合抑制剂。如果使用二级抗体，确认它不会与Fc受体阻断剂结合。

流式细胞仪

9.补偿调节不足

利用单染色对照和荧光减一（FMO）对照为每次实验设定补偿。

染色结果异常

同型对照染色超过受检抗体

1.使用的同型对照浓度不对

使用与检测抗体浓度相同的同型对照。

2.同型对照来自于不同厂家

使用与实验抗体同一厂家生产的同型对照。

FSC/SSC散射特征异常

3.固定/破膜液影响细胞特性

调整FSC/SSC电压，使细胞处于可视范围之内。

4.刺激条件改变细胞特性

使用标志物反设门识别细胞。调整FSC/SSC电压，使细胞处于可视范围之内。

假阳性染色

5.分析中包含细胞黏连体或死细胞

单细胞群设门，并使用活性染料，排除黏连体和死细胞。

补偿值异常升高

6.PMT设定电压设定不正确

根据样本优化电压设定。

7.细胞采集数量不够

如要检测非均匀细胞群里的罕见细胞，为使统计上有意义，应遵照泊松统计采集一定数量的细胞。